熒光是光致發(fā)光的一種發(fā)光現象。當某些物質受到光、電、磁、化學能激發(fā)時，電子吸收能量并從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的電子不穩(wěn)定。它將通過輻射躍遷和非輻射躍遷回到基態(tài)。輻射躍遷的衰變過程伴隨著光子的發(fā)射，產生熒光和磷光。非輻射躍遷包括振動弛豫、內部轉換和系間跨越。非輻射躍遷會造成能量損失，發(fā)射光子的能量一般小于吸收光子的能量。因此，熒光物質的發(fā)射光譜波長通常大于吸收光譜波長。

一 熒光探針需要滿足的條件

1.易于合成和純化，收率高，安全無毒。

2.穩(wěn)定性和溶解性好，特別是脂溶性透膜性好。

3、通過物理化學作用與標記物質特異性結合，標記條件溫和。殘留物和副產物很容易去除。

4.熒光量子產率高，摩爾消光系數大，抗漂白能力強。熒光與背景形成鮮明對比。此外。激發(fā)和發(fā)射波長可以有效避免細胞自發(fā)熒光的背景干擾。

二 近紅外（NIR）熒光探頭的優(yōu)點

1、近紅外光檢測樣品穿透力強、成像分辨率高、檢測靈敏度高、信噪比高。

2.在可見光區(qū)域，生物組織的某些成分會自激發(fā)產生自發(fā)熒光。并且樣品的散射光強度較高，嚴重干擾熒光檢測和成像追蹤。近紅外熒光自發(fā)熒光背景低。

三 檢測細胞內活性小分子（RSM）的NIR方法

細胞中的RSM往往壽命短、反應活性高、濃度極低、對環(huán)境敏感且不發(fā)出熒光。因此，必須借助熒光探針的特異性捕獲標記才能具有近紅外熒光特性。

四 熒光探針廣泛應用于生物大分子研究的原因

分子熒光探針廣泛用于研究蛋白質和其他生物大分子接觸表面的表面誘導構象變化。在直接分析方法中，熒光分析方法應用廣泛，且優(yōu)于間接分析方法，因為它不破壞結合平衡，接近反應的真實存在。

五熒光探針作為光敏劑藥物的能量供體

熒光納米探針不僅可以作為藥物載體與光敏藥物分子結合形成多功能納米材料，還可以作為光敏藥物分子的能量供體，提高其單線態(tài)氧產生效率。

光敏劑和熒光染料的吸收光譜、熒光發(fā)射光譜重疊較少。有效避免分子間能量轉移引起的熒光猝滅、單線態(tài)氧生成效率降低、熒光成像等。在熒光成像的同時，光敏劑強制激發(fā)產生的單線態(tài)氧也可能與激發(fā)態(tài)發(fā)生光化學反應。熒光探針并引起熒光猝滅?；蛘咚赡軙┞读孔狱c在成像過程中潛在的毒副作用。因此，設計合適的納米載體結構將光敏劑藥物分子與熒光探針物理隔離是避免此類光化學反應的有效方法。

六、熒光分子探針的組成及功能

1.受體

它選擇性地與物體（分析物）結合并引起探針所在的化學或生物微環(huán)境的變化。

2.熒光團

識別基團與分析物結合而引起的化學或生物微環(huán)境變化，轉化為儀器易于感知（顏色變化）或可檢測的信號。

小分子熒光探針一般采用有機小分子熒光團，包括蒽、香dou素、熒光素、BODIPY、萘二甲酰亞胺、羅丹明、花青等。其衍生物的發(fā)射波長范圍幾乎覆蓋所有可見光區(qū)域（400-800 nm）。并且通過對這些熒光團進行適當修飾，可以實現藍、綠光到紅光和近紅外光（650-900 nm）的覆蓋。此外，發(fā)光量子點、上轉換納米材料、高分子聚合物熒光材料、熒光蛋白等也可作為熒光探針中的信號基團。

3.墊片

連接熒光基團和識別基團，有效地將識別信息轉化為熒光信號，如熒光強度的變化、熒光光譜的移動、熒光壽命的變化等。從而實現對治療檢測對象的有效檢測。并非所有探針都有連接基團。

七 熒光探針可檢測生物體物質

1.質子(H+)。

2.自由基和其他活性氮和氧物種（ROS、RNS）。

3.氣體信號分子（NO、CO、H2S……）

4.重金屬污染（Cd2+.Hg2+.Pb2+…）

5.陰離子(Cl-, HCO3-, H2PO4-, HPO42-...)

6.過渡金屬離子(Fe2+/Fe3+, Zn2+, Cu+/Cu2+…)

7.堿金屬和堿土金屬離子（K+、Na+、Ca2+、Mg2+…）

8.DNA、RNA、蛋白質等生物大分子。

9、有機小分子如肽、葡萄糖、麥芽糖等。

八、熒光探針的種類

根據與客體相互作用后熒光信號的變化，可分為強度變化型熒光探針和比例計型熒光探針。強度變化型熒光探針分為猝滅型（ON-OFF）和增強型（OFF-ON）熒光探針。

強度變化型熒光探針根據熒光強度的變化實現客體物種的檢測。由于熒光強度還受到探針濃度、激發(fā)光源效率、探針所處環(huán)境等因素的影響，此類探針在客體物種的定量檢測中也存在明顯的局限性。目前，大多數熒光探針都是增強型熒光探針。

比率熒光探針本身也發(fā)射一定波長的熒光。其明顯的優(yōu)點是可以通過兩個波長下熒光強度的比值來消除大部分環(huán)境因素的干擾，從而實現在探針濃度未知的情況下對被測物種的定量檢測。

九 熒光探針的設計機理

傳統(tǒng)的分子探針設計原理包括光誘導電子轉移（PET）、分子內電荷轉移（ICT）、扭曲分子內電荷轉移（TICT）、金屬配體電荷轉移（MLCT）、電子能量轉移（EET）、熒光共振能量轉移（FRET） ）、激發(fā)態(tài)分子內質子轉移（ESIPT）、激發(fā)態(tài)準分子/激基復合物形成等。新興機制包括聚集誘導發(fā)射（AIE）、上轉換發(fā)光（UCL）等。

十 光電子轉移（PET）

一般來說，光致電子轉移（PET）工藝分為兩種類型。一種是電子從電子供體轉移到激發(fā)態(tài)熒光團（電子受體），激發(fā)態(tài)熒光團被還原而引起熒光猝滅。另一種是電子從激發(fā)態(tài)熒光團（電子供體）轉移到激發(fā)態(tài)熒光團（電子受體）。電子受體、激發(fā)態(tài)熒光團被氧化導致熒光猝滅。當物體未結合時，熒光團和受體之間的 PET 將淬滅熒光。物體結合后，PET 過程受到抑制，熒光團發(fā)出熒光。

十一、分子內電荷轉移（ICT）

分子內電荷轉移也稱為光誘導電荷轉移（PCT），也是設計比例熒光探針的重要方法。這類熒光探針的識別基團直接與熒光團相連，也可以理解為組成熒光團的某些原子或基團直接參與客體的識別。

十二 熒光共振能量轉移（FRET）

熒光共振能量轉移（FRET）是能量轉移（ET）的一種。能量轉移是指分子中能量從供體發(fā)色團向受體發(fā)色團轉移的過程。 FRET 效率通常通過調整光譜重疊程度和供體-受體距離來改變。

十三激發(fā)分子內質子轉移（ESIPT）

ESIPT現象是指化合物分子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，然后質子通過分子內氫鍵轉移到分子中相鄰的N、S、O雜原子上，形成相應互變異構體的過程。

十四準分子/激基復合物形成

準分子（Er）可以定義為由相同結構的激發(fā)熒光團和基態(tài)熒光團相互作用形成的締合體。同樣，如果處于激發(fā)態(tài)的熒光團和處于基態(tài)的具有不同結構的熒光團形成復合物，則稱為激發(fā)態(tài)復合物。