αL阿拉伯呋喃糖苷酶（αLAf）測(cè)試盒（比色法）

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

α-L-Af 是一種能夠水解非還原呋喃阿拉伯糖殘基的糖苷酶類(lèi)，使細(xì)胞壁阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯甘露聚糖等中性糖不斷解離，促進(jìn)果膠的增溶和降解。由于果實(shí)成熟過(guò)程中常常伴隨著阿拉伯糖的喪失，該酶活性在果實(shí)成熟軟化中的研究具有重大意義。

測(cè)定原理：

α-L-Af分解對(duì)硝基酚阿拉伯呋喃糖苷生成對(duì)-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算α-L-Af活性。

自備用品：

酶標(biāo)儀/可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入2.5mL蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二：液體4mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體13mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定（在EP管或96孔板中依次加入下列試劑）：

迅速混勻，放入37℃保溫30min

充分混勻， 400nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)，計(jì)算ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

α-L-Af活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y =0.00585x -0.0027；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y為吸光值。

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每min產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-L-Af活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每小時(shí)產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-L-Af活性(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-L-Af活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.08×(ΔA +0.0027)

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.07mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.0039x -0.0027；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y為吸光值。

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每小時(shí)產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-L-Af活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每小時(shí)產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-L-Af活性(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-L-Af活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.12×(ΔA +0.0027)

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.07mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。

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